++Nanopore의 가장 최신 버전인 R9을 기준으로 작성되었습니다.
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인간 게놈 프로젝트의 종료 후, 10년동안 차세대 염기서열 해독법 (Next Generation Sequencing, 이하 NGS) 기술의 비약적인 발전이 있었다. +Illumina 혹은 IonTorrent와 같은 2세대 NGS 기술은 매우 강력하지만, 100-500bp 길이의 short read만 시퀀싱이 가능하다. +따라서 2세대 기술은 반복서열, 복제수변이 (CNV)와 같이 유전체의 복잡한 구조를 이해하는데에는 한계가 존재한다.
+이러한 문제들을 해결하기 위해서 많은 연구들이 지속적으로 진행되었고, 그 결과 3세대 기술들이 등장하게 되었다. +3세대 기술의 대표적인 예로는 Pacific Bioscience사의 SMRT 시퀀싱 기술과 Oxford Nanopore Technologies사의 Nanopore 시퀀싱 기술이 있다.
+SMRT 시퀀싱은 형광을 사용하여 측정한다는 점에서 기존의 2세대 NGS와 유사하다. 하지만, short read가 아니라 long read까지도 시퀀싱이 가능하다는 점이 다르다. +우수한 기술력을 가진 PacBio사는 2018년에 Illumina사가 long read 시퀀싱 기술력 확보를 위해 인수 되었다.
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PacBio사와는 반대로 독자적인 행보를 걷고 있는 Oxford Nanopore Technologies (이하 ONT)는 나노포어를 사용하여 기존과는 색다른 방식으로 시퀀싱을 한다. +2012년에 첫 상품인 MinION을 발표하였다. MinION은 long read 시퀀싱이 가능한 포터블 나노포어 기기이며, 이는 많은 사람들의 관심을 한 몸에 받았다.
+하지만 나노포어 기술에도 몇가지 문제점들이 존재했고, 이를 ONT에서 지속적인 업데이트를 통해 보완하는 작업을 진행중에 있다. +현재는 R9.4 버전의 나노포어 기술이 발표된 상태이다.
+그렇다면 도대체 이 나노포어는 무엇이고, 어떻게 나노포어를 가지고 시퀀싱을 하는 것일까? +본 글에서는 나노포어와 나노포어 시퀀싱 기술에 대해 간략하게 소개를 하고자 한다.
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나노포어란?
+Nanopore(이하 나노포어)는 문자 그대로 nano-meter 크기의 매우 작은 초소형 구멍을 뜻한다. +생물세포내에 존재하는 나노포어는 주로 외부의 물질들을 내부로 보내는 역할을 한다. +이러한 특징을 응용하여 많은 연구원들은 나노포어를 가지고 특정 물질을 전달하는 시스템이나 유전자 시퀀싱에 이용하기 시작하였다.
+나노포어는 크게 두가지 종류로 나뉘어진다.
+1. Solid-state 나노포어
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- 생물학적 나노포어를 본따, 전도체를 사용하여 nano-meter 사이즈로 만든 나노포어 +
- 주로 실리콘, 알루미늄, 그래핀 등의 전도체로 나노포어를 만든다. +
- 생물학적 나노포어의 성능은 완벽하게 균일하지 않지만, solid-state 나노포어는 획일화된 제조 공정을 통해 성능을 어느정도 균일하게 만들수 있다는 장점이 있다. +
2. Biological 나노포어
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- 박테리아 혹은 다른 생물세포내에 존재하는 단백질형태의 나노포어 +
- DNA 시퀀싱에 가장 많이 이용되는 4가지 종류
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- alpha-hemolysin +
- MspA +
- CsgG +
- bacteriophage phi 29 +
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나노포어 시퀀싱 방법
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- 나노포어를 전기 저항을 띄고 있는 멤브레인 표면에 설치함. +
- Leader motor가 시퀀싱하고자 하는 dsDNA에 부착됨. +
- 나노포어의 구멍속으로 dsDNA가 차례차례 통과함. 이때, 통과되는 속도는 leader motor가 dsDNA를 single strand로 풀어지는 속도에 의해 조절됨. +
- 일정한 크기의 전압을 나노포어에 지속적으로 걸어줌. +
- 나노포어의 구멍 내부에 DNA가 지나가게되면, 나노포어의 저항 값이 증가함. +
- ‘옴의 법칙’에 따라 저항값이 증가하게 되면, 균일한 전압을 맞추기 위해 전류의 값이 감소함. +
- 감소하는 전류 값을 통해 ACTG 핵산 및 methylation을 구분할 수 있음. +
- 실시간으로 기록된 전류값의 변화를 통해 시퀀싱 정보를 얻음. +
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나노포어 시퀀싱의 장단점
+장점
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- Read length를 길게 시퀀싱 가능 (kilo-base) +
- 빠른 시퀀싱 속도 +
- 실시간 분석 가능 +
- 증폭 필요 없음 => base modification 혹은 methylation 정보를 잃지 않음 +
단점
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- 나노포어안에 하나의 nucleotide가 들어가 있는게 아니라, 한번에 4-5개의 nucleotide가 들어감. +따라서, 반복되는 시퀀스를 구분하는데에 약간의 어려움이 존재. (= 호모폴리머 이슈) +
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R9 나노포어 시퀀싱 개선점
+2016년 5월에 ONT사에서 R9 버전으로의 업데이트를 발표하였다. +R9 버전에서는 나노포어 종류와 분석 알고리즘 두가지가 개선되었다.
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- 나노포어 변경; CsgG 사용 (기존 alpha-hemolysin 포어) +
- 속도 빨라짐; 250bp/s +
- Hairpin ligation 없이 사용 가능
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- 기존에는 leader motor가 dsDNA를 반으로 나누어주면서 나노포어로 들어가게 되고, 말단에서는 hairpin motor가 dsDNA를 묶어줌으로써 나노포어로 들어가는 속도를 조절해줌 +
- 기존 2D read => 1D^2 read +
+ - 분석 알고리즘 RNN으로 변경 (기존의 HNN 알고리즘 보다 더 빠르고 정확한 분석) +
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- ONT CsgG 포어 관련
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- E.coli가 가지고 있는 CsgG 포어 단백질의 변이체 +
- polypeptide를 translocate시키는 역할
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- Engineering을 통해 펩타이드 대신, DNA가 잘리도록 바꿈 (냠냠 먹어버리는것과 같은 효과!) +
- recombinant DNA 기술로 나노포어 생산함 +
+ - 36개의 베타-배럴 모양이 9개의 서브유닛을 이루어 pore 형성 +
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자료 출처:
+[1] A.Magi et al. Briefings in Bioinformatics, 2017, 1-17
+[2] N.Kono et al. Develop Growth Differ. 2019; 1-11
+[3] ONT website
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이상으로 나노포어 시퀀싱 기술에 대해 간략하게 알아보았습니다.
+다음 글에서는 나노포어 시퀀싱으로 얻어진 전류 데이터가 어떻게 유전체 정보로 바뀌는지 ONT사의 분석 프로세스에 대해 +간단하게 소개하고자 합니다.
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